Экспериментальное тестирование химиорезистентности опухолевых клеток рака яичников

ВВЕДЕНИЕ

Злокачественные эпителиальные опухоли яичников — гетерогенная группа новообразований, занимающая одно из ведущих мест в структуре онкологической заболеваемости и смертности [1]. Общая 5-летняя выживаемость при данной патологии составляет около 50 % [2].

Современные подходы к лечению больных с вновь выявленным раком яичников (РЯ) включают циторедуктивное хирургическое вмешательство, как правило в сочетании с платиносодержащей химиотерапией (ХТ) [3, 4]. Рецидив заболевания после первичного лечения развивается у 70—80 % пациенток [5]. Тактика лечения больных с рецидивами зависит от времени, прошедшего от момента окончания курса ХТ 1-й линии до возникновения рецидива. Как правило, повторно назначают ХТ. При этом у 10—40 % пациенток с вновь выявленным РЯ платиносодержащая ХТ изначально неэффективна [6, 7]. В случае развития рецидива РЯ эффективность терапии не превышает 66 % [8].

В соответствии с современными клиническими рекомендациями эффективность лекарственного лечения злокачественных опухолей оценивают по результатам объективного обследования пациента после проведения ХТ [9]. На сегодняшний день предложен ряд методик, позволяющих предсказывать результаты лечения до его начала на основании данных молекулярно-генетических анализов или экспериментального тестирования резистентности/чувствительности клеток опухоли к лекарственному препарату [10—12].

Первоначально экспериментальные предиктивные тесты были направлены на определение индивидуальной чувствительности опухолевых клеток к цитостатикам с целью выбора наиболее эффективного препарата для ХТ, однако оказалось, что выявление резистентности опухоли имеет более высокую прогностическую значимость, чем чувствительности [13]. Это связывают с гетерогенностью опухоли и возможностью существования резистентного клона опухолевых

клеток вне взятого для анализа образца опухолевой ткани, а также с влиянием на метаболизм противоопухолевого препарата микроокружения и в целом организма.

Возможность использования экспериментального тестирования при выборе препаратов для проведения 2-й и 3-й линий ХТ при РЯ в настоящее время остается предметом активных научных изысканий [14]. Целесообразность подобных исследований обусловлена неэффективным расходованием дорогостоящих противоопухолевых препаратов в случае химиорезистентности опухолевых клеток и неоправданным ущербом, наносимым организму пациента высокотоксичными цито-статиками при наличии изначальной резистентности опухоли к ним.

Наиболее распространенный подход к экспериментальному определению резистентности клеток опухоли пациента к химиотерапевтическому препарату основан на использовании так называемых CSR-тестов (Chemotherapy Sensitivity and Resistance assays). Существует множество различных видов CSR-тестов, и в ряде стран некоторые из них используют в клинической практике для предиктивного определения резистентности опухолевых клеток к препарату [8, 15, 16]. В частности, в Германии для определения химиорезистентности клеток РЯ в клинической практике используют набор ATP-Tumor Chemosensitivity Assay (ATP-TCA) (DCS Innovative Diagnostik-Systeme, Германия) [17]. В Российской Федерации в настоящее время наборы для экспериментального определения резистентности опухолевых клеток конкретного пациента к химиопрепаратам не зарегистрированы.

С учетом вышеизложенного разработка новых экспериментальных методик определения резистентности клеток опухоли у пациентов с РЯ является актуальной задачей.

Цель исследования — разработка экспериментальной методики определения резистентности опухолевых клеток РЯ к химиотерапевтическим препаратам.

Для решения этой цели поставлены следующие задачи:

1) выбрать гипоадгезионные условия культивирования клеток РЯ, способствующих формированию сфероидов;

2) определить изменение количества жизнеспособных клеток РЯ в течение первых 6 дней культивирования в гипоадгезионных условиях;

3) определить оптимальные условия выполнения теста на жизнеспособность клеток по метаболизму резазурина;

4) сравнить результаты определения резистентности клеток линий РЯ, получаемых с использованием разработанной методики и набора ATP-TCA;

5) проанализировать дозовые зависимости к химио-препаратам при использовании разработанного протокола тестирования в отношении опухолевых клеток пациенток с РЯ, получавших лечение в Национальном медицинском исследовательском центре онкологии им. Н.Н. Блохина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Опухолевые клетки. В исследовании использовали линии клеток РЯ A-1847, Ovcar-3 и Ovcar-4, предоставленные профессором Р.Г. Киямовой (Казанский (Приволжский) федеральный университет), а также первичные культуры клеток, полученные из образцов опухолевой ткани и асцитической жидкости пациенток с серозной аденокарциномой яичников III—IV стадии, получавших лечение в Национальном медицинском исследовательском центре онкологии им. Н.Н. Блохина.

Культивирование клеток в стандартных условиях. Клетки культивировали во флаконах 75 см2 (Eppendorf, Германия) в среде DMEM с содержанием глюкозы 4,5 г/л («ПанЭко», Россия), добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (10 %) (Biosera, Франция), смеси антибиотиков пенициллина (50 ед/мл) и стрептомицина (50 мкг/мл) («ПанЭко», Россия), L-глутамина (2 мМ) («ПанЭко», Россия) в стандартных условиях (37 °C, 5 % CO2). Пассирование клеток проводили по достижении ими уровня конфлюентности 80—90 %.

Культивирование клеток в гипоадгезионных условиях. Культивирование в гипоадгезионных условиях осуществляли в количестве 20 000 клеток на образец следующими способами: 1) в 200 мкл бессывороточной среды, приготовленной на основе DMEM с содержанием глюкозы 4,5 г/л с 25 мМ HEPES и без него («ПанЭко», Россия), альбумина человеческого (0,4 %) (Baxter AG, Австрия), инсулин-трансферрин-селенита (инсулин — 0—10 мкг/мл, трансферрин — 0—5,5 мкг/мл, селенит натрия — 0—6,7 нг/мл) («ПанЭко», Россия), смеси антибиотиков пенициллина (50 ед/мл) и стрептомицина (50 мкг/мл) («ПанЭко», Россия), L-глутамина (2 мМ) («ПанЭко», Россия) в 96-луночных полипропиленовых планшетах (Corning, США); 2) в 200 мкл бессывороточной среды Complete Assay Medium (CAM)

(DCS Innovative Diagnostik-Systeme, Германия) в низкоадгезионных 96-луночных полипропиленовых планшетах, входящих в состав набора ATP-TCA.

Получение сфероидов и их гистологический анализ. Для гистологического исследования опухолевые клетки культивировали в гипоадгезионных условиях с использованием бессывороточной среды на основе DMEM с содержанием 4,5 г/л глюкозы с HEPES, 0,4 % альбумина человеческого (Baxter AG, Австрия), инсу-лин-трансферрин-селенита (инсулин — 10 мкг/мл, трансферрин — 5,5 мкг/мл, селенит натрия — 6,7 нг/мл) («ПанЭко», Россия), смеси антибиотиков пенициллина (50 ед/мл) и стрептомицина (50 мкг/мл) («ПанЭко», Россия), L-глутамина (2 мМ) («ПанЭко», Россия), которая далее указана как бессывороточная среда для тестирования резистентности 3 (БСТР3), в 96-луночных полипропиленовых планшетах (Corning, США). Сформировавшиеся при культивировании 3D-структуры (сфероиды) после осаждения центрифугированием при 150 g в течение 5 мин, фиксировали в 70 % этиловом спирте и помещали в агарозный гель, используя агарозу с низкой температурой плавления (Bio-Rad, США). Фрагменты агарозного геля, содержащие клеточные структуры, обезвоживали в течение 3 сут с применением серии спиртов восходящей концентрации (70°, 96°, 100°), а затем хлороформа. Парафиновые блоки получали с использованием среды Histomix (BioVitrum, Россия). Серийные срезы (5 мкм) депарафинизировали, окрашивали гематоксилином Майера (BioVitrum, Россия) и водно-спиртовым эозином (BioVitrum, Россия) и заключали в монтирующую среду (Bio-Optica, Италия) для выполнения гистологического и цитологического исследований. Анализ гистологических препаратов и фотографирование изображений проводили с использованием микроскопа Olympus CX31 (Olympus, Япония) (х40), оснащенного цифровой камерой Olympus SC50 (Olympus, Япония).

Определение количества жизнеспособных клеток. Количество жизнеспособных клеток определяли с использованием 3 подходов: 1) выявляли нарушения целостности клеточной мембраны с помощью окрашивания трипановым синим; 2) оценивали активность метаболизма клетками резазурина; 3) определяли внутриклеточный уровень аденозинтрифосфата (АТФ).

Определение количества жизнеспособных клеток с использованием окрашивания трипановым синим. Суспензию клеток и сфероидов переносили в пробирки объемом 1,5 мл и центрифугировали при 150 g в течение 5 мин. Осадок клеток ресуспендировали в 50 мкл раствора Версена («ПанЭко», Россия), после повторного центрифугирования ресуспендировали осадок в 50 мкл 0,05 % раствора трипсина-ЭДТА (ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота) («ПанЭко», Россия) и инкубировали при 37 °С в течение 5 мин. После 3-го центрифугирования осадок ресуспендировали в 200 мкл среды DMEM с содержанием 4,5 г/л глюкозы («ПанЭко», Россия). Суспензию клеток смешивали в соотношении 10:1 с 0,4 % раствором трипанового синего (Gibco, США) и помещали в камеру Горяева.

Прямой подсчет клеток и расчет их концентрации, а также процентного содержания жизнеспособных (неокрашенных) и погибших (окрашенных) клеток проводили с использованием микроскопа Nikon Eclipse TS 100 (Nikon, Япония) (*40).

Оценка жизнеспособности клеток по метаболизму резазурина. К 200 мкл среды культивирования клеток добавляли 20 мкл раствора резазурина (Sigma-Aldrich, США) с концентрацией 180 мкг/мл. После инкубации с резазурином в течение 4—16 ч переносили 150 мкл культуральной среды каждого из образцов в черный 96-луночный планшет (SPL Life Sciences, Корея) и измеряли уровень флуоресценции резоруфина (продукт метаболизма резазурина с длиной волны возбуждения — 560 нм, эмиссии — 590 нм) с помощью планшетного флуориметра SpectraMax M3 (Molecular Devices, США).

Оценка жизнеспособности клеток по уровню АТФ. Для определения внутриклеточного уровня АТФ к 200 мкл среды культивирования добавляли 50 мкл реагента для лизиса опухолевых клеток (Tumor Cell Extraction Reagent, DCS Innovative Diagnostik-Systeme, Германия) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем 50 мкл лизата переносили в белый 96-луночный планшет (Costar, США) и после добавления 50 мкл люциферин-люциферазного реагента (Luciferin-Luciferase Reagent, DCS Innovative DiagnostikSysteme, Германия), предварительно разведенного согласно инструкции производителя в буфере для разведения (Dilution Buffer, DCS Innovative Diagnostik-ysteme, Германия), измеряли уровень люминесценции с использованием люминометра Berthold Orion II (Berthold, Германия).

Получение первичных культур опухолевых клеток злокачественных новообразований яичников. Первичные культуры опухолевых клеток от пациенток с РЯ получали из образцов асцитической жидкости и опухолевой ткани. Клетки асцитической жидкости осаждали с использованием центрифуги Hettich Universal 320R (Hettich Zentrifugen, Германия) при 150 g в течение 5 мин. Для удаления эритроцитов клеточный осадок инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре в 5 мл лизис-буфера АСК (Gibco, США), содержащего 155 мМ NH4Cl, 10 мМ KHCO3 и 0,1 мМ ЭДТА. Клетки дважды осаждали центрифугированием и ре-суспендировали в среде DMEM с содержанием 4,5 г/л глюкозы. Образец опухолевой ткани измельчали механически до кусочков размером в 1 мм3, помещали в 10 мл раствора коллагеназы А (1 мг/мл) в бессывороточной среде и инкубировали на шейкере-инкубаторе Heidolph Unimax 1010 (Heidolph Instruments, Германия) при температуре 37 °С в течение 2,5—6 ч. Для удаления эритроцитов из образца использовали методику, описанную выше. Клетки дважды осаждали центрифугированием с последующим ресуспендированием в среде DMEM с содержанием 4,5 г/л глюкозы.

Обработка клеток цитостатиками. Обработку клеток цитостатиками проводили в гипоадгезионных условиях, добавляя в среду культивирования противоопухолевые препараты: цисплатин (Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина, Россия), паклитаксел (Teva, Израиль), доксорубицин (Pfizer, Италия). Клетки культивировали в присутствии 6 концентраций цитостатиков, составляющих 200; 100; 50; 25; 12,5 и 6,25 % тестовой концентрации препарата (test drug concentration, TDC). В качестве TDC использовали следующие концентрации препаратов: для цисплатина — 3,8 мкг/мл, для паклитаксела — 13,6 мкг/мл, для доксорубицина — 0,5 мкг/мл.

Определение резистентности клеток линий рака яичников и первичных культур. Клетки линий РЯ и первичных культур злокачественных новообразований яичников после обработки цитостатиками культивировали в гипоадгезионных условиях. На 5-й день в бессывороточную среду культивирования БСТР3 добавляли раствор резазурина в концентрации 180 мкг/мл и определяли жизнеспособность клеток через 16 ч по уровню флуоресценции резоруфина, или на 6-й день в среду культивирования CAM добавляли 50 мкл реагента для лизиса опухолевых клеток и определяли жизнеспособность клеток по уровню АТФ.

В качестве показателя подавления роста опухоли (tumor growth inhibition, TGI) использовали соотношение уровней жизнеспособности клеток в присутствии 1 из 6 концентраций цитостатика и без добавления цитостатика, рассчитываемое по формуле:

TGI % TDC = [1 — (I% TDC — I0) / (Itdc0 — I0)] х 100 %,

где TGI % TDC — подавление роста опухоли при культивировании клеток в концентрации цитостатика, соответствующей указанному проценту от TDC; I% TDC — средний показатель интенсивности флуоресценции/ люминесценции в образце при культивировании клеток в соответствующей концентрации цитостатика; ITDC0 — средний показатель интенсивности флуоресценции/люминесценции в образце при культивировании клеток без препаратов; I0 — средний показатель интенсивности флуоресценции/люминесценции в образце культураль-ной среды.

Индекс резистентности/чувствительности (RSI) рассчитывали по формуле:

RSI = 600 — Е (TGI.25 % TDC + TGI + TGI + 12,5 % TDC 1 25 % TDC + TGL + TGI + TGI T 100 % TDC T 200 % TDC),

где RSI — индекс резистентности/чувствительности; TGI6 25 % TDC — подавление роста опухоли при культивировании клеток в концентрации цитостатика, соответствующей 6,25 % TDC; TGI12 5 % TDC — подавление роста опухоли при культивировании клеток в концентрации

цитостатика, соответствующей 12,5 % TDC; TGI25 % TDC — подавление роста опухоли при культивировании клеток в концентрации цитостатика, соответствующей 25 % TDC; TGI50 % TDC — подавление роста опухоли при культивировании клеток в концентрации цитостатика, соответствующей 50 % TDC; TGI100 % TDC — подавление роста опухоли при культивировании клеток в концентрации цитостатика, соответствующей 100 % TDC; TGI200 % TDC — подавление роста опухоли при культивировании клеток в концентрации цитостатика, соответствующей 200 % TDC.

Статистическая обработка полученных данных. Статистический анализ данных проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8.4.3. Статистическую значимость различий интенсивности флуоресценции между образцами с различным количеством жизнеспособных клеток оценивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с пост-тестом Тьюки. Статистическую значимость различий RSI рассчитывали с помощью ^-критерия Стью-дента. Различия для всех методов считались статистически значимыми приp <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Формирование SD-структур клетками рака яичников при культивировании в гипоадгезионных условиях. Прототипом разрабатываемой методики экспериментального определения индивидуальной резистентности опухолей пациенток со злокачественными новообразованиями яичников к противоопухолевым препаратам послужил используемый в настоящее время в клинической практике набор реагентов и расходных материалов ATP-TCA (DCS Innovative Diagnostik-Systeme, Германия). Методика, используемая в ATP-TCA, предполагает культивирование опухолевых клеток, полученных из биологических образцов больных в количестве 15 000—25 000 в лунке в течение 6 дней в 6 последовательно понижающихся концентрациях цитостатического агента (200; 100; 50; 25; 12,5 и 6,25 % TDC). TDC, применяемые в этом тесте, воспроизводят максимальные концентрации препаратов, определяемые в плазме пациенток при проведении курсов ХТ [18]. Культивирование клеток в ходе теста ATP-TCA осуществляют в гипоадгезионных условиях с применением бессывороточной среды CAM и низкоадгезионных 96-луноч-ных полипропиленовых планшетов (DCS Innovative Diagnostik-Systeme, Германия), что, благодаря неспособности ряда нормальных клеток выживать в подобных условиях, обеспечивает увеличение доли опухолевых клеток и, соответственно, возможность более объективно оценивать резистентность/чувствительность именно злокачественных клеток [19]. Использование гипоадгезионных условий при культивировании способствует образованию из злокачественных эпителиальных клеток 3D-структур, в частности сфероидов, резистентность/чувствительность которых более объективно отражает резистентность/чувствительность опухоли в организме, чем при использовании 2D-мо-нослойных культур злокачественных клеток [20].

Результаты анализа данных литературы позволили выяснить, что в качестве необходимых добавок в бессывороточной среде используют альбумин, инсулин, трансферрин, селенит, L-глутамин и смесь антибиотиков пенициллина и стрептомицина [21]. На основании этих сведений на начальном этапе разработки методики составлены несколько вариантов БСТР, которые были использованы для оценки способности опухолевых клеток РЯ формировать 3D-структуры (сфероиды).

Клетки линий А-1847, Ovcar-3 и Ovcar-4 культивировали в бессывороточных средах в 96-луночных полипропиленовых планшетах (Corning, США) в количестве 20 000 клеток на образец. На 6-й день сформировавшиеся 3D-структуры осаждали центрифугированием и проводили гистологический анализ сфероидов. По данным микроскопического анализа наилучшие результаты по формированию сфероидов получены для БСТР3, которая и была использована в дальнейшем исследовании (рис. 1).

Рис. 1. Микроскопия сфероидов, образовавшихся после культивирования суспензии клеток линий рака яичников: а — A-1847; б — Ovcar-3; в — Ovcar-4. Окраска гематоксилином и эозином, у-50мкм

Определение динамики количества жизнеспособных клеток рака яичников при культивировании в гипоадгезионных условиях. Клетки линий РЯ А-1847, Ovcar-3 и Ovcar-4 культивировали в гипоадгезионных условиях в БСТР3 в 96-луночных полипропиленовых планшетах (Corning, США). Количество живых клеток в образце оценивали ежедневно до 6-го дня культивирования с использованием трипанового синего.

Установлено, что на 2-й и 3-й дни культивирования количество жизнеспособных клеток рака яичника линии А-1847 увеличивается в 2,1 и 2,4 раза по сравнению с 1-м днем соответственно, а затем начинает снижаться и составляет 177, 99 и 73 % на 4-, 5- и 6-й дни соответственно. Клетки Ovcar-3 продемонстрировали меньшую способность к пролиферации в гипоадгези-онных условиях. На 2-й и 3-й дни культивирования количество жизнеспособных клеток составило 85 и 87 % соответственно по отношению к 1-му дню, но на 4-, 5- и 6-й дни увеличилось до 117, 137 и 141 % соответственно. При культивировании клеток линии Ovcar-4 на 2-й день их жизнеспособность снизилась до 94 %, а затем, в течение последующих 3—6 дней культивирования количество живых клеток в образце составило 127—148 % от исходного (рис. 2).

Таким образом, при использовании указанного протокола культивирования клеток РЯ в гипоадгезионных условиях к 5-6-му дням культивирования сохраняется высокая доля жизнеспособных клеток, что позволяет использовать данные условия при проведении теста на химиорезистентность опухолевых клеток in vitro.

Рис. 2. Динамика относительного количества жизнеспособных клеток рака яичников, культивируемых в гипоадгезионных условиях в бессывороточной среде для тестирования резистентности 3

Определение оптимального количества клеток и времени инкубации при выполнении теста на жизнеспособность по метаболизму резазурина. В качестве метода определения жизнеспособности в тесте АТР-ТСА используется люминометрия, позволяющая оценить уровень АТФ, хорошо коррелирующий с количеством живых клеток. В ходе разработки методики мы решили определить возможность использования флуориметрии после добавления резазурина вместо люминометрии в качестве метода количественной оценки жизнеспособности клеток. Выбор флуориметрии обусловлен довольно высокой чувствительностью этого метода, а также его доступностью, воспроизводимостью и удобством в использовании. Также его преимуществом является наличие флуориметров (в отличие от люминометров), которые зарегистрированы в Российской Федерации.

Определение влияния цитостатиков на жизнеспособность клеток после добавления резазурина основано на зависимости интенсивности сигнала флуоресценции резоруфина — продукта метаболизма резазурина, образуемого в определенный интервал времени, — от количества клеток в образце. Поскольку минимальное количество клеток, которое должно быть в образце, ограничено чувствительностью метода детекции сигнала, а максимальное — полным истощением субстрата реакции, необходимо определить оптимальное количество клеток для добавления в образец для проведения теста на химиорезистентность. Кроме того, из-за отсутствия единого протокола регистрации жизнеспособности клеток методом флуориметрии после добавления резазурина важно выяснить оптимальное время культивирования клеток с этим соединением до проведения флуори-метрии. Для решения вышеуказанных задач определен уровень значимости различий интенсивности флуоресценции резоруфина между образцами с разным количеством клеток РЯ, культивируемых с данным соединением в течение различных временных интервалов.

Образцы с различным количеством клеток РЯ линий А-1847, Огсаг-3 и Огсаг-4, полученные путем серий двукратного разведения от 80 000 до 156 клеток/образец, культивировали в БСТР3 в полипропиленовых планшетах в течение 4, 8, 12 и 16 ч после добавления резазурина. Затем оценивали жизнеспособность клеток по метаболизму резазурина методом флуориметрии. Полученные данные использовали для определения статистической значимости различий интенсивности флуоресценции между образцами с различным количеством жизнеспособных клеток, оцениваемой с помощью однофакторного дисперсионного анализа АКОУА с пост-тестом Тьюки (табл. 1—3).

Согласно полученным данным при определении жизнеспособности клеток по метаболизму резазурина оптимальным является 10 000—30 000 клеток в образце. Поскольку к 5-6-му дням количество клеток всех используемых линий РЯ составило от 73 до 148 % от изначально добавленных в образец (см. рис. 2), в качестве оптимальной для постановки теста была выбрана концентрация 20 000 клеток в образце. Дополнительно установлено, что увеличение времени инкубации с резазурином с 4 до 16 ч приводит к увеличению статистически значимых различий в интенсивности флуоресценции образцов, содержащих более низкие концентрации клеток. Это можно рассматривать в качестве аргумента в пользу выбора 16 ч в качестве требуемого интервала обработки клеток, поскольку обработка цитостатиком должна приводить к уменьшению количества клеток. В то же время увеличение продолжительности инкубации клеток с резазурином для линии Отсаг-4 с 4 до 16 ч приводит к исчезновению различий в интенсивности флуоресценции в образцах, содержащих изначально 80 000 и 40 000 клеток. В связи с этим определение интенсивности флуоресценции при инкубации с резазурином в течение 16 ч свидетельствует о необходимости контроля над количеством клеток в образце.

Таким образом, при анализе образцов, изначально содержащих 10 000-30 000 клеток, инкубация с реза-зурином продолжительностью 12-16 ч была признана в качестве оптимальной.

Сравнительный анализ определения резистентности опухолевых клеток линий рака яичников и первичных культур с использованием теста ATP-TCA и разработанного протокола тестирования. Для оценки результатов тестирования с использованием набора реактивов АТР-ТСА проводят расчет RSI, отражающего дозозависимый эффект гибели клеток при их культивировании в разных концентрациях цитостатика. Результаты ряда исследований показали корреляцию значения RSI с клиническим ответом на терапию цитостатиком, включая показатели безрецидивной и общей выживаемости [18, 22].

В ходе сравнительного анализа результатов тестирования на резистентность, полученных с использованием набора АТР-ТСА и разработанного нами протокола, включающего культивирование клеток в БСТР3 в полипропиленовых планшетах и оценку жизнеспособности по метаболизму резазурина (протокол БСТР3-РЕЗ), для всех клеточных культур РЯ при применении обоих методов получена дозовая зависимость гибели клеток от концентрации цисплатина, паклитаксела и доксорубицина. Кривые доза—эффект для линий клеток РЯ A-1847, Ovcar-3 и Ovcar-4 для ци-сплатина представлены на рис. 3. Использование набора АТР-ТСА основано на наличии дозозависимого эффекта. Его получение в протоколе БСТР3-РЕЗ позволило рассчитать и сравнить RSI для обоих методов (рис. 4). Следует отметить, что статистически значимых различий в RSI (^-критерий Стьюдента), рассчитанных в соответствии с результатами тестов при использовании ATP-TCA и БСТР3-РЕЗ, при воздействии цисплатина, паклитаксела и доксорубцина для всех линий РЯ выявлено не было (см. рис. 4).

Результаты исследования культур клеток РЯ позволили перейти к тестированию химиорезистентно-сти с использованием протокола БСТРЗ-РЕЗ на первичных культурах клеток, полученных из образцов опухолевой ткани и асцитической жидкости пациенток с РЯ (пациентки 1—3). Выявлена возможность регистрации дозозависимого эффекта гибели клеток от концентрации цитостатика (рис. 5—7).

ОБСУЖДЕНИЕ

Первоначально для прогноза резистентности к ХТ при РЯ использовали монослойные первичные культуры и ксенографты. Стабильные двумерные культуры просты и легки в использовании. Однако в процессе пассирования ткань опухоли утрачивает гетерогенность, поскольку выживают только клетки, способные адаптироваться к существованию in vitro. Кроме того, в этих культурах не только отсутствуют стромальные клетки, но и изменены условия формирования внеклеточного матрикса. В результате этого профили экспрессии генов опухолевых клеток и клеток, существующих in vivo, различаются, что отражается на результатах тестирования, снижает прогностическую значимость таких тестов [14]. Использование ксено-графтов РЯ в тестах на химиорезистентность не получило широкого применения в силу ограниченности успеха имплантации опухоли, трудоемкости процедуры, большой продолжительности роста имплантата и высокой стоимости метода.

Рис. 3. Дозозависимые эффекты гибели клеток линий рака яичников A-1847 (а), Ovcar-3 (б) и Ovcar-4 (в) в присутствии цисплатина. Данные получены с использованием протокола, включающего культивирование клеток в бессывороточной среде для тестирования резистентности 3 (БСТР3) в полипропиленовых планшетах и оценку жизнеспособности по метаболизму резазурина (БСТР3-РЕЗ), и с применением набора ATP-Tumor Chemosensitivity Assay (ATP-TCA) (DCS Innovative Diagnostik-Systeme, Германия). Показатель подавления роста опухоли представлен как среднее значение ± стандартное отклонение. TDC – тестовая концентрация препарата

Шагом вперед в развитии экспериментального тестирования опухолей на химиорезистентность стало использование переживающих 3D-культур, которые в большей степени сохраняют свойства исходной опухоли, такие как гетерогенность, клеточная/ядерная атипия и экспрессия биомаркеров. Создание 3D-куль-тур РЯ с жизнеспособностью, достаточной для оценки их резистентности к химиопрепаратам, является непростой задачей, поскольку опухолевые клетки существуют в определенных условиях микроокружения, включающих внеклеточный матрикс и растворимые молекулы пара-, аутокринной и гуморальной регуляций. Одним из перспективных подходов является использование матригеля при культивировании опухолевых клеток в питательной среде, содержащей такие нишевые факторы, как ламинин, коллаген IV типа, нидоген, гепаринсульфат гликопротеин, факторы роста и матриксные металлопротеиназы. В данных условиях трехмерные структуры могут существовать в течение месяца и формировать стабильные 3D-культуры, сохраняющие профиль резистентности к химиопрепаратам, характерный для исходной опухоли [23].

Для экспресс-анализа резистентности конкретной опухоли к химиопрепаратам могут быть использованы 3D-культуры с упрощенными условиями культивирования и более кратким временем их использования — от 5 до 10 дней [22]. Путем варьирования состава бессывороточной среды мы подобрали вариант среды БСТР3. В ней клетки стабильных линий РЯ формировали жизнеспособные сфероиды, что подтверждено с помощью их гистологического анализа. Результаты оценки динамики роста клеток линий РЯ при культивировании в БСТР3 в полипропиленовых планшетах показали, что количество жизнеспособных клеток линий РЯ на 6-й день составило от 73 до 148 % от исходного. Это позволило сделать вывод о возможности использования данных условий при экспериментальном тестировании опухолевых клеток на химиорезистентность. Жизнеспособность клеток определяли по уровню флуоресценции резоруфина — продукта метаболизма резазурина. Оценка жизнеспособности клеток по их метаболической активности является стандартным, распространенным подходом при работе с культивируемыми клетками [11]. Ранее в качестве метаболизируемого соединения чаще всего использовали 3-(4,5 -диметилтиазол-2-ил)-2,5 -дифенилтетразолия бромид, известный под названием МТТ, однако применение вместо него резазурина, метаболизируемого более широким спектром ферментов по сравнению с МТТ до флуоресцирующего резоруфина, повысило чувствительность и надежность метода.

Рис. 4. Индексы резистентности/чувствительности клеток линий рака яичников A-1847 (а), Ovcar-3 (б) и Ovcar-4 (в) для цисплатина, паклитаксела и доксорубицина (t-критерий Стьюдента). Данные получены с использованием протокола, включающего культивирование клеток в бессывороточной среде для тестирования резистентности 3 (БСТР3) в полипропиленовых планшетах и оценку жизнеспособности по метаболизму резазурина (БСТР3-РЕЗ), и с применением набора ATP-Tumor Chemosensitivity Assay (ATP-TCA) (DCS Innovative Diagnostik-Systeme, Германия) и представлены как среднее значение + стандартное отклонение

Еще более чувствительным и надежным методом, разработанным для использования вместо МТТ-теста, является метод Се1ГШег^1о®, основанный на измерении количества АТФ. Однако для детекции АТФ требуются люминометры, которые не используются в медицинских учреждениях нашей страны. В связи с этим в настоящем исследовании использован реза-зуриновый метод. В то же время интегральный уровень флуоресценции резоруфина в образце зависит от множества факторов: условий культивирования клеток, уровня метаболической активности ферментов, количества клеток, продолжительности инкубации с детектирующим агентом и некоторых других параметров [24]. В связи с этим получение релевантных воспроизводимых результатов резазуринового теста, направленного на определение жизнеспособности клеток конкретного нозологического типа опухолей требует валидации условий его проведения. Для валидации метода определения жизнеспособности клеток по уровню метаболизма резазурина проанализированы различия в интенсивности флуоресценции резоруфина в образцах с разным количеством клеток РЯ и в продолжительности инкубации (см. табл. 1—3). Показано, что оптимальным для данного способа определения жизнеспособности клеток является их количество в образце от 10 000 до 30 000. Принимая во внимание показатели динамики количества жизнеспособных клеток на 6-й день инкубации (73—148 %), сделан вывод, что использование 20 000 клеток в исходном экспериментальном образце является оптимальным. Также установлено, что 12—16 ч — это оптимальная продолжительность инкубации с резазурином опухолевых клеток РЯ 3 рассматриваемых линий, если количество клеток в образце не превышает 40 000. Такая продолжительность инкубации является допустимой из-за низкой цитотоксичности резазурина [25]. Таким образом, мы разработали протокол культивирования опухолевых клеток РЯ в гипоадгезионных условиях, позволяющий протестировать химиорезистентность.

Рис. 5. Дозозависимые эффекты гибели опухолевых клеток в присутствии цисплатина (а), паклитаксела (б) и доксорубицина (в). Индексы резистентности для цисплатина, паклитаксела и доксорубицина (г). Данные получены с использованием протокола, включающего культивирование клеток в бессывороточной среде для тестирования резистентности 3 (БСТР3) в полипропиленовых планшетах и оценку жизнеспособности по метаболизму резазурина (БСТР3-РЕЗ), и с применением набора ATP-Tumor Chemosensitivity Assay (ATP-TCA) (DCS Innovative Diagnostik-Systeme, Германия) для первичной культуры рака яичников из образца опухолевой ткани пациентки 1

Рис. 6. Дозозависимые эффекты гибели опухолевых клеток в присутствии цисплатина (а), паклитаксела (б) и доксорубицина (в). Индексы резистентности для цисплатина, паклитаксела и доксорубицина (г). Данные получены с использованием протокола, включающего культивирование клеток в бессывороточной среде для тестирования резистентности 3 (БСТР3) в полипропиленовых планшетах и оценку жизнеспособности по метаболизму резазурина (БСТР3-РЕЗ), и с применением набора ATP-Tumor Chemosensitivity Assay (ATP-TCA) (DCS Innovative Diagnostik-Systeme, Германия) для первичной культуры рака яичников из образца опухолевой ткани пациентки 2

В качестве прототипа разрабатываемого протокола определения химиорезистентности in vitro рассматривается созданный рядом исследователей метод выявления химиорезистентности опухолевых клеток РЯ с использованием набора АТР-ТСА. Его преимуществами являются простота, межлабораторная воспроизводимость и то, что он применяется в клинической практике в Германии. На 3 стабильных линиях и первичных культурах РЯ с использованием созданного нами протокола тестирования химиорезистент-ности продемонстрирована возможность регистрации дозозависимого эффекта гибели клеток в присутствии цитостатиков. Дополнительно в ходе сравнительного анализа результатов определения химиорезистентно-сти опухолевых клеток, полученных с использованием протокола БСТРЗ-РЕЗ и набора АТР-ТСА, выявлено отсутствие значимых различий в значениях RSI. Результаты пилотного исследования пригодности разработанных нами упрощенных условий анализа резистентности/чувствительности первичных 3D-культур солидных и асцитических вариантов РЯ (образцы операционного материала пациенток) показали, что данные тестирования по разработанному протоколу практически не отличаются от данных, полученных с использованием стандартного метода, принятого за рубежом.

Рис. 7. Дозозависимые эффекты гибели опухолевых клеток в присутствии: цисплатина (а), паклитаксела (б) и доксорубицина (в). Индексы резистентности для цисплатина, паклитаксела и доксорубицина (г). Данные получены с использованием протокола, включающего культивирование клеток в бессывороточной среде для тестирования резистентности 3 (БСТР3) в полипропиленовых планшетах и оценку жизнеспособности по метаболизму резазурина (БСТР3-РЕЗ), и с применением набора ATP-Tumor Chemosensitivity Assay (ATP-TCA) (DCS Innovative Diagnostik-Systeme, Германия) для первичной культуры рака яичников из образца опухолевой ткани пациентки 3

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Тестирование химиорезистентности опухолевых клеток в первичных 3D-культурах основано на взаимосвязи уровня их жизнеспособности в присутствии цитостатика в концентрациях, сопоставимых с содержанием в организме пациента, и клиническими результатами терапии этим агентом. Выявленное нами дозозависимое влияние цитостатиков на жизнеспособность опухолевых клеток в 3D-культурах пациенток с РЯ свидетельствует о перспективности дальнейших исследований, направленных на определение корреляции между результатами экспериментального тестирования и клиническими данными. Для этой цели может быть использован разработанный нами упрощенный метод получения первичных 3D-куль-тур, который соответствует стандарту, принятому за рубежом.