Системы доставки агонистов STING для иммунотерапии злокачественных новообразований

Введение

По мере накопления знаний о врожденных защитных реакциях организма на внедрение патогенов росла осведомленность о роли внутриклеточных структур в сигнальных путях иммунитета, приводящих к значительной продукции цитокинов. К подобным компонентам иммунной системы относится STING (STimulator of INterferon Genes – стимулятор генов интерферона). Впервые данная молекула была выделена и описана в 2008 г. как белок, локализованный преимущественно в эндоплазматическом ретикулуме, имеющий массу примерно 42 кДа. С момента относительно недавнего открытия белка STING и по настоящее время подробно описано его непосредственное участие в реализации иммунного ответа при вирусных и бактериальных инфекциях, клеточном старении, аутофагии и в развитии аутоиммунных заболеваний [1–4].

Сегодня роль сигнального пути STING в качестве терапевтической мишени для иммунотерапии различных онкологических заболеваний рассматривается как многообещающая и перспективная (рис. 1). Белок STING ассоциирован с cGAS (cyclic GMPAMP synthase – синтаза циклического ГМФ-АМФ). Данный фермент связывается с молекулами ДНК различного происхождения, попавшими в цитоплазму клетки, образуя минимально активную ферментативную единицу, катализирующую димеризацию гуанозинтрифосфата (ГТФ) и аденозинтрифосфата (АТФ) в циклический гуанозиномонофосфат-аденозиномонофосфат (цГАМФ). Связавшиеся цГАМФ с белком STING инициируют каскад реакций, приводящий к активации факторов транскрипции IRF3 и NF-κB, чем в итоге стимулируется значительная выработка цитокинов, в первую очередь интерферонов I типа [4–6].

Рис. 1. Сигнальный путь белка STING (stimulator of interferon genes). Данный и рис. 2 созданы с помощью biorender.com

Исследования показали тесную связь сигнального пути STING с формированием противоопухолевого иммунитета. Вырабатываемые интерфероны стимулируют созревание дендритных клеток, ускоряют их миграцию к лимфатическим узлам, способствуя перекрестной активации опухоль-специфических CD8+-Т-клеток (CD – cluster of differentiation, кластер дифференцировки). Помимо этого, интерфероны повышают экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости на поверхности клеток, стимулируют выработку хемокинов и подавляют иммуносупрессивное действие регуляторных Т-клеток. Таким образом, активация сигнального пути STING в опухолевых клетках может служить барьером для прогрессирования неоплазии [7, 8]. Роль данного сигнального пути в модуляции противоопухолевых реакций привела к фармацевтической разработке агонистов STING. Однако их системное введение сопряжено с серьезными проблемами. Поскольку данный белок является компонентом врожденной иммунной системы, активация сигнального пути может привести к чрезмерной выработке провоспалительных цитокинов и серьезным побочным эффектам, в том числе к септическому шоку. Протоколы клинических исследований (КИ) некоторых агонистов STING, например TAK-676 (идентификатор КИ NCT04879849), ADU-S100 (идентификатор КИ NCT02675439) или E7766 (идентификатор КИ NCT04144140), предполагали их внутриопухолевое введение.

Хотя такие инъекции и эффективны с точки зрения минимизации системной токсичности, они подходят не во всех клинических случаях. Степень васкуляризации опухоли, а также ее морфологические свойства могут вызывать значительные отклонения в прогнозируемом распределении препарата в месте инъекции [9, 10].

Следовательно, для агонистов STING перспективна разработка подходов, способствующих оптимизации их клинического применения и минимизирующих нецелевую токсичность. К подобным подходам можно отнести создание новых молекулярных и супрамолекулярных конструкций, которые бы обеспечивали длительную циркуляцию препарата в организме и повышенную локализацию иммуностимулирующего действия в опухолевом очаге. Цель настоящей работы заключается в систематизировании и обобщении данных литературы о разработке систем доставки агонистов STING на основе иммуноконъюгатов (ИК), липосом и полимерных наночастиц (НЧ).

Иммуноконъюгат как система доставки агонистов STING

В качестве системы, состоящей из терапевтических агентов, связанных с молекулами, опознаваемыми иммунной системой, значительный потенциал демонстрируют ИК. Последние представляют собой ковалентно связанный цитотоксический агент, именуемый «полезной нагрузкой» (ПН), с моноклональным антителом посредством связующего фрагмента – линкера, который, в зависимости от строения, может быть расщепляемым и нерасщепляемым. Конструкция подобных молекулярных систем доставки сочетает в себе преимущества высокоспецифичной нацеливающей способности иммуноглобулина и противоопухолевой активности соединенного с ним вещества.

Природа ПН определяет эффективность ИК как лекарственного препарата. Низкая экспрессия опухолевых антигенов, а также неэффективная интернализация связавшегося с ИК рецептора могут привести к очень низким внутриклеточным концентрациям цитостатика. Сообщается о локализации на опухолевой ткани до 0,08 % от введенной дозы антител, что указывает на необходимость использовать токсины, уничтожающие клетки в минимально возможных концентрациях.

Таким образом, при разработке ИК подбирают ПН со значениями концентрации полумаксимального ингибирования, лежащими в наномолярном диапазоне. К подобным высокоактивным веществам относятся и агонисты STING [11, 12].

Конъюгация активаторов STING с моноклональными антителами является многообещающей стратегией, улучшающей их профиль безопасности при внутривенном введении. Ряд исследователей предполагает, что для данных систем доставки нежелателен побочный цитотоксический эффект (bystander effect), при котором лекарственное средство проникает в соседние клетки после высвобождения из ИК. Следовательно, агонист должен обладать низкой степенью внутриклеточной проницаемости для минимизации нецелевой токсичности в не конъюгированной с антителом форме. Препятствовать данному эффекту можно конъюгацией ПН через нерасщепляемые линкеры, поскольку конструкция такого ИК будет метаболизироваться в клетке с образованием заряженного аминокислотного фрагмента. Однако линкерам подобной структуры, в частности – тиоэфирным, подходят только небольшие молекулы, фармакофор которых удален от места конъюгации. К тому же низкий уровень интернализации клетками ИК с нерасщепляемыми линкерами может снижать эффективность их действия, поскольку ПН активна только после эндосомального разложения, а агонисты STING воздействуют на внутриклеточную структуру [11, 13–15].

Исследования показали, что увеличение нагрузки иммуноглобулина гидрофобными молекулами способно увеличивать клиренс ИК. В случае агонистов STING это чревато серьезными побочными эффектами вследствие неконтролируемой активации сигнального пути интерферона в фагоцитирующих клетках. Следовательно, для обеспечения приемлемых фармакокинетических свойств ИК, напрямую определяющих и его безопасность, необходимо, чтобы он был преимущественно гидрофильным. Варьировать данным свойством можно подбором в качестве ПН более гидрофильных агонистов STING, а также введением в структуру линкера дополнительных фрагментов, например, полиэтиленгликоля (ПЭГ), способствующих солюбилизации конструкции ИК [16, 17].

Подобный строгий подход, основанный на всестороннем изучении свойств структурных компонентов, лег в основу разработки препарата XMT-2056. Таргетный компонент ИК представлен нацеленным на HER2 (human epidermal growth factor receptor 2 – рецептор человеческого эпидермального фактора роста 2) антителом (HT-19), не конкурирующим за связывание с мишенью с трастузумабом и пертузумабом, что признается полезным свойством в реализации комбинированной анти-HER2-терапии.

В качестве ПН выбрано соединение diABZI (diamidobenzimidazole – диамидобензимидазол), специально оптимизированное для обеспечения возможности конъюгации с сохранением активности. Расщепляемый линкер на основе сложного эфира оптимизирован солюбилизирующими группами, такими как ПЭГ и бисглюкамин, что позволило получить стабильную конструкцию in vivo.

Предварительные результаты биологических испытаний XMT-2056 показали высокую активность ИК в отношении HER2-экспрессирующих опухолей, как вмонотерапии, так и в комбинации с ингибиторами контрольных точек иммунного ответа.

Помимо этого, препарат хорошо переносился приматами в значительно более высоких дозах, чем те, что требуются для реализации противоопухолевого действия. В настоящее время XMT-2056 дошел до КИ в качестве средства лечения прогрессирующих рецидивирующих солидных HER2-положительных опухолей [13, 18, 19].

Еще одним ИК, дошедшим до КИ, является TAK500, содержащий в качестве ПН производное циклического динуклеотида (ЦДН) TAK-676. Конструкция TAK-500 включает расщепляемый пептидный линкер, соединяющий агонист STING с антителом, нацеленным на CCR2 (C–C chemokine receptor type 2 – рецептор С-С-хемокинов 2-го типа). Данный экспрессируемый миелоидными клетками белок – это рецептор хемокинов CCL (C–C chemokine ligands – лиганды С-С-хемокинов), способствующий в ряде случаев уклонению опухоли от иммунного ответа. Показано, что блокада взаимодействия CCL с CCR2 усиливает противоопухолевый иммунный ответ посредством увеличения активности цитотоксических Т-лимфоцитов, стимулирования созревания CD103+-дендритных клеток и снижения экспрессии лиганда программируемой гибели клеток (programmed cell death-1 – PD-1, programmed cell death-ligand 1 – PD-L1). Следовательно, TAK-500 реализует свое действие как путем направленной активации сигнального пути интерферона, так и перепрофилированием иммуносупрессивного микроокружения опухоли. Подобный подход обладает потенциалом преодоления резистентности опухоли к терапии ингибиторами контрольных точек иммунного ответа [20–22]. На рис. 2 показаны дизайн ИК и различные варианты ПН, представленной агонистами STING.

Рис. 2. Дизайн иммуноконъюгата с агонистами STING (stimulator of interferon genes) [13, 21, 23–26]

Наноструктурные системы доставки агонистов STING

Наноструктурные системы доставки веществ широко представлены в качестве средств диагностики и терапии онкологических заболеваний. Благодаря своей относительно большой площади поверхности, облегчающей функционализацию различными лигандами, НЧ могут быть адаптированы под любую клиническую задачу, а их биосовместимость и способность инкапсулировать широкий спектр веществ способствуют снижению выраженности побочных эффектов при системном введении.

«Эффект повышенной проницаемости», парадигма которого заключается в наличии разрывов между эндотелиальными клетками кровеносных сосудов, долгое время считался основополагающим механизмом пассивного накопления НЧ в опухолевой ткани. Однако последние исследования демонстрируют его незначительную роль в распределении наноструктур, поскольку частота образования таких разрывов в сосудистой ткани опухоли достаточно невелика.

Имеющиеся данные о доставке в солидные опухоли примерно 0,7 % от числа введенных НЧ могут объяснять их скудное клиническое использование. В иммунотерапии неоплазий наноконтейнеры способны раскрыться в качестве эффективного инструмента, поскольку даже небольшое количество дошедших до патологической ткани НЧ, нагруженных иммунотерапевтическими агентами, способны вызвать устойчивый противоопухолевый ответ [27–30].

Опосредованная НЧ доставка агонистов STING способна исправить ряд ограничений, связанных с их структурой. Нативные лиганды STING – ЦДН являются гидрофильными отрицательно заряженными молекулами с энзиматически нестабильной фосфодиэфирной связью. Хотя их синтетические аналоги с фосфотиоатной эфирной связью более устойчивы к действию гидролаз, растворимость в воде и наличие заряда по-прежнему могут ограничивать пассивное проникновение молекул через клеточную мембрану. Помимо этого, химическая модификация структуры ЦДН осложняется лабильностью сахарно-фосфатных звеньев. Инкапсуляция в НЧ природных ЦДН способна выступать в качестве удобной альтернативы химическому синтезу их новых производных [31, 32].

Липосомальные формы агонистов STING

Липосомы, будучи сферическими липидными везикулами с водным ядром, могут заключать в себе гидрофильные молекулы, в том числе ЦДН. Так, S.Koshy и соавт. исследовали катионные липосомы в качестве системы доставки фосфотиоатного производного цГАМФ.

Везикулы, состоящие из 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропана (DOTAP), холестерина и липида с фрагментом ПЭГ массой 2000 Да (DSPEPEG2000), были получены методом гидратации тонкой липидной пленки с последующими циклами «замораживания – оттаивания» и экструзией дисперсии через поликарбонатные мембраны.

Полученные таким образом НЧ инкапсулировали приблизительно 20 % ЦДН, что является типичным результатом пассивной загрузки гидрофильных молекул. ПЭГ-модификация липосом значительно увеличивала их стабильность в среде, содержащей белок, но снижала положительный заряд НЧ, изменяя их фармакокинетические свойства.

Липосомы без ПЭГ быстро поглощались дендритными клетками in vitro, однако ограниченно накапливались в опухолевом очаге при интратуморальном введении, что в итоге снижало активность препарата в отношении ортотопической модели мышиной меланомы B16-F10. Тем не менее показано, что инкапсуляция в липосомы ЦДН способна усилить активацию сигнального пути STING по сравнению со свободным препаратом, а дальнейшая оптимизация характеристик НЧ может повысить эффективность терапии, в том числе формировать иммунологическую память против рецидива опухоли [33, 34].

1. Cheng и соавт. разработали липосомальныйцГАМФ и исследовали эффект препарата в отношении базальноподобного трижды-негативного рака молочной железы, устойчивого к терапии ингибиторами PD–L1. Что наиболее ценно, ученые так же оценили эффект разработанных НЧ на генно-модифицированной мышиной модели, наиболее точно имитирующей протекание данного заболевания у человека.

Липосомы были сконструированы схожим с описанным в работе S. Koshy и соавт. методом, но с использованием L-α-фосфатидилхолина и DOTAP в массовой пропорции 100 к 1 соответственно. Получившийся препарат представлял собой однородную дисперсию (индекс полидисперсности – polydispersity index, PDI = 0,124) со средним гидродинамическим размером частиц приблизительно 85 нм, инкапсулирующих примерно 43 % цГАМФ.

Значительные противоопухолевые эффекты липосомального цГАМФ наблюдались как в отношении ортотопических, так и генно-модифицированных моделей опухоли. Заключенный в НЧ цГАМФ превосходил свободный в способности преобразовывать макрофаги М2-фенотипа в М1-фенотип, а также в способности активации цитотоксических Т-лимфоцитов. Подобным образом заключенный в липосомы природный ЦДН способен потенцировать как врожденный, так и адаптивный противоопухолевый иммунный ответ [35].

Так, P. Atukorale и соавт. исследовали возможность доставки ЦДН совместно с агонистом Toll-подобного рецептора 4, монофосфолипидом А, который ранее был одобрен для применения в качестве адъюванта вакцин.

Будучи гидрофобным соединением, монофосфолипид А при получении липосом встраивался в фосфолипидный бислой, тогда как гидрофильный ЦДН локализовался в водном ядре. Липосомы, нагруженные 2 агонистами одновременно, вызывали выработку интерферона, которая была в 7–10 раз выше, чем при использовании липосомальных форм исследуемых веществ по отдельности [36]. В контексте биотерапии опухолевых метастазов в легких Y. Liu и соавт. исследовали ингаляционную липосомальную систему доставки цГАМФ.

Препарат был получен путем двухэтапного обратного микроэмульгирования и представлял собой достаточно однородную и стабильную дисперсию НЧ, имеющих отрицательный поверхностный заряд и средний размер примерно 118 нм. Эффективность инкапсуляции составила более 71 %, а особенность липосомальной конструкции обеспечивала высвобождение нагрузки только при кислых значениях pH, характерных для эндосом.

Фосфатидилсерин на поверхности липосом обеспечивал их преимущественное поглощение антигенпрезентирующими клетками, тем самым, по-видимому, способствуя минимизации местной и системной токсичности при применении препарата.

Комбинация ингаляции липосомального цГАМФ с лучевой терапией способствовала выработке сильного противоопухолевого иммунного ответа, приводящего у некоторых мышей к полной регрессии опухолевых метастазов в легких. Разработанная исследователями система доставки способствует преодолению иммуносупрессивного микроокружения опухоли как в облученных, так и необлученных участках легких [37]. Химическая модификация нативной структуры агониста STING – полезное подспорье для облегчения встраивания данных веществ в липосомальные везикулы. Так, X. Chen и соавт. создали гидрофобные пролекарства ненуклеотидного активатора MSA-2 и исследовали их липосомальную форму. Поскольку исходная молекула MSA-2 является кислотой (pKa = 4,78 ± 0,05), для оптимизации получения липосом методом инъекции растворителя в буфер с рН = 7,4 исследователи получили сложноэфирные дериваты данного агониста, отличающиеся между собой длиной углеродной цепи гидрофобного фрагмента. Полученные пролекарства MSA-2 были совместимы с липидными компонентами, а эффективность их загрузки в везикулы превышала 90 %. Воздействие таких липосомальных конструкций, именуемых SAProsomes (STING agonist pro-drug liposomes – липосомы-пролекарства агониста STING), на клетки привело к значительно большей экспрессии белков, регулируемых STING, по сравнению с воздействием на них свободного MSA-2.

При оценке на доклинической мышиной модели опухоли MC38 SAProsomes показали себя хорошо переносимыми препаратами, внутривенное введение которых значительно тормозило рост опухоли.

При оценке на ортотопической модели рака молочной железы 4T1 SAProsome-3 демонстрировал заметную терапевтическую эффективность в отношении как первичной опухоли, так и метастазов по сравнению с лечением MSA-2 [38, 39].

Физико-химические свойства липосом в значительной мере определяют их взаимодействие с клетками и последующую реализацию биологического эффекта. Известно, что преобладание в составе липосом липида с низким значением температуры фазового перехода обеспечивает жидкокристаллическое состояние мембраны везикул при физиологической температуре, что облегчает их фузию с опухолевыми клетками. В дополнение к свойству текучести мембраны P. Yuan и соавт. выявили зависимость эластичности содержащих цГАМФ липосом от их способности доставлять нагрузку в иммунокомпетентные клетки.

С этой целью были получены варьирующиеся по упругости везикулы с показателями модуля Юнга 15, 40 и 149 МПа. Для облегчения нацеливания на макрофаги и дендритные клетки липосомы функционализировали маннозными лигандами. Установлено, что везикулы средней эластичности (модуль Юнга = 40 МПа) в наибольшей степени способствуют выработке белков иммунного ответа, что обусловлено, предположительно, особенностями взаимодействия липосом с клеточной мембраной. Так, самые эластичные везикулы в основном адсорбировались на мембране клеток, а наиболее упругие подвергались эндоцитозу. В свою очередь, везикулы средней эластичности, сливаясь с клеточной мембраной, высвобождали гидрофильный цГАМФ непосредственно в цитоплазму [40, 41].

Полимерные носители агонистов STING

Полимерные НЧ имеют значительный потенциал в области доставки биологически активных веществ, обусловленный возможностью изменения физико-химических свойств каркасного полимера. Введение в его структуру различных групп обеспечивает возможность точного контроля над размером и морфологией частиц, а также способствует повышению коллоидной стабильности дисперсии. Функционализация полимеров, из которых состоят НЧ, позволяет добиться хорошо подобранной реакции на эндогенные стимулы, инициирующие высвобождение нагрузки. Подобная гибкая настройка свойств полимера, исследованного D. Nguyen и соавт., позволила получить самосборную конструкцию, нагруженную цГАМФ.

Носитель, состоящий из сополимера мембран-дестабилизирующего бутилметакрилата (BMA), ПЭГилированного метакрилата и рН-чувствительного диэтиламиноэтилметакрилата (diethylaminoethyl methacrylate – DEAEMA), обеспечивал высвобождение агониста STING в цитозоль в ответ на кислую среду эндосом, физически их разрушая. При этом эндосомолитическая активность самосборных НЧ коррелировала с молекулярной массой ПЭГилированных мономеров. Полимеросомы, несущие фрагменты ПЭГ молекулярной массой 300 Да, активно доставляли цГАМФ в цитозоль, тогда как НЧ, содержащие фрагменты ПЭГ массой 950 Да, были практически неактивными in vitro, что может объясняться стерическими препятствиями и недостаточной степенью протонирования pH-селективного мономера. Хотя при оценке активности in vivo на модели меланомы B16-F10 интрамуральное введение НЧ на основе исследуемого полимера показало улучшенную доставку цГАМФ в клетки опухоли по сравнению со свободным, в будущем необходимы дальнейшие исследования для определения характеристик системно применимых составов полимеросом [42–44].

Возможность системного применения подобных эндосомолитических полимеросом описана D. Shae и соавт. Полимер-носитель так же состоял из блоков мембран-дестабилизирующего BMA и pH-чувствительного DEAEMA. Отличительными особенностями являлись введение в структуру более тяжелых цепей ПЭГ, обеспечивающих коллоидную стабильность, и введение тиол-реактивного пиридилдисульфидэтилметакрилата (pyridyl disulfide ethyl methacrylate, PDSMA), обеспечивающего сшивание in situ цепей полимера внутри мембраны везикулы под действием дитиотреитола. Подобное решение позволяет увеличить молекулярную массу цепи полимера, тем самым усилив эндосомолитическую активность.

Условия полимеризации были подобраны таким образом, чтобы на каждую цепь полимера приходилось в среднем по 2 группы PDSMA, что предотвращало образование полностью сшитой структуры мембраны полимеросом, тем самым сохраняя баланс между эффективностью инкапсуляции гидрофильного цГАМФ в везикулы и адекватностью реакции на стимул его высвобождения. Образуемые диспергированием полимера в воде НЧ со средним гидродинамическим размером приблизительно 80 нм имели нейтральный заряд при pH 7,4, а эффективность загрузки препарата в везикулы составила около 38 %.

Внутриопухолевое введение полимеросом с цГАМФ мышам с меланомой B16-F10 привело к 11-кратному снижению скорости роста опухоли по сравнению со свободным активатором STING. При внутривенном введении НЧ отмечалось замедление роста подкожной опухоли B16-F10, тогда как системное применение цГАМФ практически не дало терапевтического эффекта. Помимо этого, нанопрепарат усилил эффект терапии ингибиторами контрольных точек иммунного ответа, что характеризовалось обеспечением стойкой ремиссии у 40 % получавших такое лечение мышей в течение 55 дней.

При изучении фармакокинетического профиля данных НЧ было установлено, что инкапсулирование в них цГАМФ увеличило период полувыведения вещества в 40 раз и значительно повысило биодоступность. Различия между периодом полувыведения пустых полимеросом (6,4 ч) и инкапсулированного в них цГАМФ (1,3 ч) может объясняться диффузией молекул агониста STING через мембрану везикул, что потребует в дальнейшем определенных химических и технологических подходов, направленных на минимизацию утечки. Хотя системное применение НЧ сопровождалось кратковременным снижением массы тела, гистологический анализ не выявил признаков повреждения печени.

Анализ распределения препарата в организме показал, что примерно 15 % от вводимой дозы цГАМФ в полимеросомах накапливалось в печени, менее 2 % – в селезенке, что приводило к активации сигнального пути STING и временному повышению уровня цитокинов в сыворотке крови. Тем не менее для реализации терапевтически значимого эффекта было достаточно приблизительно 3 % от введенной дозы инкапсулированного цГАМФ, дошедшего до сформировавшихся опухолей B16-F10 [45, 46].

Описанная ранее наноконструкция была апробирована для совместной доставки с ЦДН неоантигенных пептидов. Известно, что для надежной стимуляции длительного противоопухолевого иммунного ответа вакцинацией неоантигенными пептидами рационально использование адъювантов, специфически взаимодействующих с компонентами системы врожденного иммунитета. Наиболее часто используется агонист Toll-подобного рецептора 3 poly-I:C (polyinosinic: polycytidylic acid – полиинозиновая-полицитидиловая кислота).

Группа исследователей во главе с D. Shae использовала в качестве адъюванта фосфотиоатный аналог цГАМФ, который коинкапсулировался с пептидами в pH-чувствительные полимеросомы. Эффективность загрузки пептидов коррелировала с их гидрофобностью, что может отражать преимущественную ассоциацию молекул с мембраной или водным ядром везикулы. Подобная двухфазная структура полимеросом является важным преимуществом при доставке персонализированных неоантигенных пептидов, обладающих широким спектром свойств, в частности – растворимостью в воде [47, 48].

Поскольку ЦДН – отрицательно заряженные молекулы, для их эффективной цитозольной доставки целесообразно использовать катионные полимеры. Поли-β-аминоэфиры представляют собой удобный инструмент генной инженерии благодаря способности полимера электростатически взаимодействовать с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами, образуя НЧ размером 50–200 нм.

Помимо того, существует широкая возможность функционализации полимерной системы доставки путем как электростатической сорбции образуемых НЧ отрицательно заряженных таргетных лигандов, так и химической модификацией нативной структуры полимера. Подход к доставке производных ЦДН, ML-RR-CDA и RR-CDG с помощью поли-β-аминоэфиров был реализован D. Wilson и соавт. В результате скрининга, проводимого на клетках THP1-Blue™, была отобрана структура полимера PBAE 447, синтезированного из мономеров 1,4-бутандиолакрилата и 4-гидроксибутиламина в молярном соотношении 1,1:1,0 соответственно.

По концам цепей полимер был модифицирован метилпиперазиновыми фрагментами, что дополнительно способствовало повышению селективности доставки ЦДН в иммунные клетки. Полимерные НЧ, полученные смешением ЦДН и PBAE 447 в массовом соотношении 1:500, имели средний диаметр приблизительно 100 нм и заряд примерно +10 мВ.

Несмотря на то что исследуемая полимерная система доставки характеризуется относительной простотой состава и теоретической возможностью масштабирования производства с применением микрофлюидных технологий, способ введения препарата, по-видимому, ограничен опухолевой тканью [49–53].

Молекула агониста STING может быть включена непосредственно в структуру полимера, образующего супрамолекулярный ансамбль, высвобождающий нагрузку в ответ на экзогенные стимулы. При разработке полимерной in situ-системы доставки ненуклеотидного агониста MSA-2 J. Jiang и соавт. выбрали ультразвук (УЗ) как релевантный стимул вследствие его относительной биологической безопасности, способности проникать глубоко в ткани и хорошей управляемости. Молекулу MSA-2 ковалентно связали с амфифильным полимером-соносенсибилизатором с помощью расщепляемого под действием синглетного кислорода ПЭГилированного линкера на основе дифеноксиэтена. Полученная структура полимера собиралась в сферические НЧ в водной среде, размер которых был примерно 30 нм и практически не изменялся при хранении в течение 20 дней в фосфатно-солевом буфере и в 10 % растворе эмбриональной бычьей сыворотки, что свидетельствует о высокой коллоидной устойчивости дисперсии.

Рассчитанная загрузочная емкость НЧ составила немногим более 6 %. Конъюгация MSA-2 с носителем не оказывала значительного влияния на оптические свойства НЧ, позволяющие их визуализировать в ближней инфракрасной области.

Конъюгация MSA2 не затронула способность полимера генерировать синглетные формы кислорода при воздействии УЗ-стимула, а непосредственно стимулочувствительность НЧ оставалась неизменной при различных значениях pH или после длительного хранения. При испытаниях in vivo на мышиной модели плоскоклеточной карциномы SCC-7 накопление НЧ в опухолевой ткани было выявлено с помощью флуоресцентной визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне.

После внутривенного применения дисперсии НЧ наблюдались интенсивные сигналы флуоресценции в местах опухоли, достигающие максимума спустя сутки после введения. Таким образом четко определяются границы опухоли для прецизионного УЗ-воздействия.

Выживаемость мышей после терапии НЧ с УЗ-воздействием в течение 32 дней составила 100 %. Медиана выживаемости в группе получавших НЧ с MSA-2, но безпоследующего воздействия УЗ, составила 12 дней, что на 5 дней меньше аналогичного показателя для группы, получавшей свободную форму агониста STING.

Системное применение in situ НЧ не сопровождалось значительной потерей веса, а уровни цитокинов в крови были такими же, как и у контрольной группы, получавшей фосфатно-солевой буфер. Следовательно, включение агонистов STING в структуру активируемого полимера in situ способно не только значительно расширить терапевтический индекс, но и обеспечить пространственно-временной контроль над иммуномодуляцией [54].

Заключение

Разработка систем доставки способствует раскрытию терапевтического потенциала агонистов STING в контексте иммунотерапии онкологических заболеваний. Описанные подходы к доставке агонистов STING способны преодолеть их основные ограничения, связанные с механизмом действия и химической структурой. Каждая из рассмотренных систем доставки предлагает уникальный набор преимуществ – от специфичности для ИК до универсальности и возможности обеспечения контролируемого высвобождения нагрузки в случае НЧ. При этом основными трудностями при разработке наноструктурных систем доставки по-прежнему остаются необходимость оптимизации их биораспределения, в том числе преодоление неспецифического фагоцитоза для максимального накопления НЧ в опухолевом узле, а также необходимость направленности действия, обеспечиваемая как функционализацией поверхности НЧ таргетными лигандами, так и подбором структурообразующих эксципиентов, способствующих высвобождению нагрузки в целевых клетках. Немаловажной практической задачей является разработка и оптимизация технологии получения подобных систем доставки, обеспечивающей выход стабильного продукта с заданными свойствами в удовлетворяющем потребности фармацевтического рынка количестве. Таким образом, будущее иммунотерапии, опосредованной активацией сигнального пути STING в злокачественных новообразованиях, неразрывно связано с разработкой состава и технологии сложных многофункциональных платформ.