Введение
В настоящее время старение и опухолевая трансформация рассматриваются как 2 основных пути клеточной дедифференцировки, ассоциированной с возрастом [1, 2]. Клетки стареющего организма оказываются перед выбором: либо дальнейшее сокращение теломер [3–5], прекращение деления и переход в состояние программированного старения (senescence), либо иммортализация и злокачественная трансформация клеток [6, 7]. В целом речь идет о 2 независимых путях дедифференцировки, однако в последнее время появились данные о возможности частичного перехода опухолевых клеток в состояние senescence, в том числе на фоне противоопухолевой терапии [8, 9]. Подробно описаны феномены клеточного старения, индуцированного химиопрепаратами (chemotherapy-induced senescence) и облучением (radiation-induced senescence), суть которых заключается в торможении пролиферации и переходе опухолевых клеток в состояние частичного старения в условиях действия минимальных, сублетальных доз химиопрепаратов или облучения [10]. Механизм подобных изменений малоизучен, и дальнейшие исследования в этом направлении могут послужить основой для разработки новых подходов к противоопухолевой терапии.
Доксорубицин – цитостатический препарат из группы антрациклиновых антибиотиков [11]. Он является интеркалирующим агентом, а также воздействует на клеточные мембраны и индуцирует накопление в клетке активных форм кислорода [12]. Доксорубицин получен из Streptomyces peucetius var. caesius в 1970-е годы и широко используется для лечения таких опухолей, как рак молочной железы (РМЖ), легкого, желудка, яичников, неходжкинской и ходжкинской лимфом, сарком и ряда опухолей у детей [13, 14].
Известны 2 основных механизма действия доксорубицина в опухолевой клетке:
- интеркаляция ДНК и нарушение процессов репарации ДНК, которые контролируются топоизомеразами;
- генерация свободных радикалов и повреждение ими клеточных мембран, ДНК и белков.
Доксорубицин может индуцировать апоптоз клеток через 24 ч в дозозависимой манере [15, 16]. В отличие от апоптоза, старение – относительно стабильное состояние с активным метаболизмом [17]. Оно является более отсроченным по времени эффектом доксорубицина. Как клетка делает выбор между гибелью или старением, пока до конца не изучено. Действие сублетальных доз доксорубицина на нормальные и опухолевые клетки сопровождается торможением клеточного деления ипереходом клеток в состояние так называемого преждевременного, нерепликативного старения. Эффект сравнительно непродолжительный, и спустя определенное время после отмены химиопрепарата клетки могут возвращаться к активному росту.
Цель исследования – изучение механизма доксорубицин-индуцированного старения в культивируемых in vitro клетках различных подтипов РМЖ и возможных путей усиления и поддержания индуцированного старения в опухолевых клетках.
В экспериментах на клеточных линиях РМЖ различного происхождения мы показали эффект преждевременного старения клеток, включая такие классические характеристики, как активация р53/р21-сигналинга, повышение активности β-галактозидазы, изменение морфологии при культивировании клеток с сублетальными дозами доксорубицина. Продемонстрирована возможность индукции и поддержания senescence-фенотипа клеток РМЖ с помощью гормональных цитостатиков. Впервые обнаружено, что подавление экспрессии ДНК метилтрансфераз потенцирует эффект преждевременного старения и предотвращает реиндукцию опухолевого роста в клетках РМЖ.
Материалы и методы
Эксперименты проводились на культивируемых in vitro клетках РМЖ MCF-7 и MDA-MB-231.
Клеточные культуры и реактивы. Клетки РМЖ человека линий MCF-7 и MDA-MB-231 культивировали в среде DMEM («ПанЭко», Россия), содержавшей 4,5 г/л глюкозы, 10 % эмбриональной сыворотки телят (FBS, HyClone, США) и гентамицин (50 ед./мл) («ПанЭко», Россия) при 37 °С и 5 % СО2 . Культивирование клеток выполняли в инкубаторе NU-5840E (NuAire, США). При анализе скорости роста количество клеток определяли с помощью МТТ-теста [18] смодификациями, описанными в работе [19]. Тест основан на восстановлении живыми клетками реагента МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2)-2,5-дифенилтетразол бромида) (AppliChem, Германия) в нерастворимые в культуральных средах кристаллы формазана.
Определение активности β-галактозидазы. Для определения активности β-галактозидазы клетки промывали 1 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS), фиксировали в 1 мл 2 % раствора формальдегида в течение 3–5 мин и отмывали в растворе PBS. Фиксированные клетки инкубировали 12–16 ч при 37 °С без СО2 в растворе: 40 мМ фосфатно-цитратного буфера; рН 6,0; 5 мМ K3 Fe(CN)6 ; 5 мМ K4 Fe(CN)6 ; 2 мМ MgCl2 ; 150 мМ NaCl; 1 мг/мл X-Gal (5-бромо-4-хлоро-3-индоилбета-D-галактопиранозид), затем отмывали в PBS и определяли количество окрашенных клеток под микроскопом.
Репортерный анализ. Для определения транскрипционной активности рецептора эстрогенов α (ERα) проводили трансфекцию клеток плазмидой, содержавшей ген – репортер люциферазы, любезно предоставленной George Reid, под контролем промотора с эстроген-респонсивным элементом [20]. Для контроля за эффективностью и потенциальной токсичностью процедуры трансфекции применяли котрансфекцию клеток плазмидой, содержавшей ген β-галактозидазы, как описано ранее в работе [19]. Активность люциферазы измеряли по протоколу производителя набора реагентов (Promega, США) на люминометре Tecan Infinite M200 Pro (Tecan, Швейцария). Активность люциферазы выражали в условных единицах как отношение уровня хемилюминесцентного сигнала к уровню оптической плотности, обнаруженной в тесте с β-галактозидазой [19].
Иммуноблоттинг. Для получения тотального клеточного экстракта к образцам клеток добавляли буфер следующего состава: 50 мM Трис-HCl pH 7,4; 1 % Igepal CA-630; 150 мM NaCl; 1 мM тетраацетата этилендиамина; 1 мM дитиотреитола; 1 мкг/мл апротинина, лейпептина и пепстатина; 1 мM фторида натрия и ортованадата натрия (Merck, США). Образцы клеточных экстрактов центрифугировали (10 000g, 10 мин, 4 °C, центрифуга Eppendorf 5417R) и проводили электрофорез и иммуноблоттинг, как описано ранее в работе [21]. В цитозольных экстрактах исследовали содержание Snail, p21, p53 и его формы, фосфорилированной по остатку Ser15, ERα, GREB1, циклина D1, CDK4, CDK6, PARP и его расщепленной формы (Cell Signaling Technology, США). Для контроля за эффективностью иммуноблоттинга использовали антитела к α-тубулину (Cell Signaling Technology, США). Детекцию хемилюминесценции проводили по протоколу, описанному в работе D. Mruk и C. Cheng [22].
Нокдаун ДНК-метилтрансферазы 3A (DNMT3A). Для получения лентивирусных частиц упаковочные клетки HEK283FT (Thermo Fisher Scientific, США) котрансфицировали плазмидой pLKO. 1-TRC (Addgene, США), кодирующей целевые шпилечные РНК (shRNA), и вспомогательными упаковочными плазмидами pΔR8.2 (Addgene, США) и pVSV-G (Addgene, США). Для получения shRNA DNMT3A использованы следующие праймеры: Forward 5’ – CCGGGCCAAGGTCATTGCAGGAACTCGAGTTCCTGCAATGACCTTGGCTTTTTG-3’; Reverse 5’ – AATTCAAAAAGCCAAGGTCATTGCAGGAACTCGAGTTCCTGCAATGACCTTGGC-3’.
Трансфекцию проводили с использованием реагента GenJect-39TM (Molecta, Россия). Для получения вирусных частиц кондиционированную среду собирали через 24 и 48 ч после трансфекции. Клетки MCF-7 инкубировали с кондиционированной средой и 8 мкг/мл полибрена (Sigma, США). Для последующего отбора инфицированных клеток в течение 4–5 дней использовали пуромицин (Sigma, США) в концентрации 1 мкг/мл.
Статистическая обработка данных. Статистическую обработку полученных данных проводили в программе Microsoft Excel. Во всех случаях различия считали значимыми при p <0,05.
Результаты
Эксперименты проводили на клетках эстрогензависимого РМЖ линии MCF-7 (люминальный А подтип), эстрогеннезависимой сублинии MCF-7/T, полученной в результате длительного культивирования клеток родительской линии в присутствии антиэстрогена тамоксифена, и клетках эстрогеннезависимого РМЖ MDA-MB-231 (трижды негативный рак).
Доксорубицин-индуцированное старение клеток MCF-7. Результаты сравнительного анализа чувствительности клеточных линий к доксорубицину продемонстрировали относительно одинаковый уровень чувствительности клеток MCF-7 и MDA-MB-231; в то же время тамоксифенрезистентные клетки MCF-7/T отличались существенно более высокой чувствительностью к доксорубицину (рис. 1).
Рис. 1. Чувствительность клеток рака молочной железы к доксорубицину. Клетки MCF-7, MDA-MB-231 и MCF-7/T культивировали в присутствии 0,2 мкМ доксорубицина в течение 3 сут с дальнейшим определением количества выживших клеток с помощью МТТ-теста. Представлено количество выживших клеток в процентах относительно контроля
При исследовании влияния доксорубицина на активность β-галактозидазы установлено, что культивирование клеток MCF-7 в присутствии 0,2 мкМ этого препарата в течение 3 сут с последующим переводом в среду без него сопровождается выраженным повышением активности β-галактозидазы на фоне частичного блока пролиферации и характерных изменений морфологии клеток, в том числе увеличения размеров, изменения формы и пластичности клеток (рис. 2, а).
Как известно, индуцированное химиопрепаратами преждевременное старение сопровождается активацией р53-сигналинга, определяющего в итоге остановку клеточного деления и переход клеток в состояние senescence. Анализ профиля сигнальных белков в клетках MCF-7, предобработанных доксорубицином, выявил типичную для нерепликативного старения активацию р53 и р21, сопровождавшуюся подавлением экспрессии циклинзависимых киназ CDK 4 и 6 (рис. 2, б).
Рис. 2. Влияние доксорубицина на активность β-галактозидазы и профиль сигнальных белков в клетках MCF-7. Клетки MCF-7, культивированные в течение 3 сут в отсутствие (контроль) или в присутствии 0,2 мкМ доксорубицина с последующим переводом в стандартную среду и окраской на β-галактозидазу (a) и иммуноблоттингом белков (б). Представлены результаты одного из 3 независимых экспериментов
Результаты исследования влияния доксорубицина на эстрогеновый сигналинг показали существенное снижение экспрессии рецептора эстрогенов (рис. 3, а) и подавление транскрипционной активности последнего (рис. 3, б).
Рис. 3. Доксорубицин и эстрогеновый сигналинг в клетках MCF-7. Клетки MCF-7 культивировали в течение 3 сут без добавок или в присутствии
0,2 мкМ доксорубицина с его последующей отменой на 5 сут. Представлены результаты иммуноблоттинга образцов клеток с антителами к рецептору эстрогенов α (ERα) (а) и определения транскрипционной активности ERα методом репортерного анализа (б)
Влияние тамоксифена на доксорубицин-индуцированное старение клеток MCF-7. В какой мере подавление эстрогенового сигналинга ассоциировано с развитием доксорубицин-индуцированного старения? Для ответа на этот вопрос проведен анализ влияния антиэстрогена тамоксифена на эффективность нерепликативного старения клеток. Обнаружено, что культивирование клеток MCF-7, предобработанных доксорубицином, в присутствии тамоксифена сопровождается значительным повышением активности β-галактозидазы (рис. 4, а). Тамоксифен приводит к подавлению эстрогенового сиг налинга нафоне практически неизменной экспрессии ER и частичному снижению ростового сигналинга без заметной активации апоптотических белков (рис. 4, б), что поддерживает клетки в состоянии пролиферативного блока и старения. Следует отметить, что действие этого препарата на исходные клетки MCF-7 в отсутствие доксорубицина не сопровождается сколько-нибудь заметным накоплением β-галактозидазы и клеточным старением (рис. 5, а), что свидетельствует о необходимости предактивации апоптотического сигналинга р53/р21 при нерепликативном старении клеток.
Рис. 4. Влияние тамоксифена на активность β-галактозидазы и профиль сигнальных белков в клетках MCF-7, предобработанных доксорубицином: а – окраска на β-галактозидазу; б – иммуноблоттинг белков. Клетки MCF-7 культивировали в течение 3 сут в присутствии 0,2 мкМ доксорубицина с его последующей отменой и культивированием в течение 3 сут без добавок (доксорубицин) и в присутствии 5 мкМ тамоксифена (доксорубицин + тамоксифен). Представлены результаты одного из 3 независимых экспериментов
При оценке пролиферативного статуса доксорубицин-индуцированных клеток мы показали, что после отмены препарата клетки постепенно, в течение 10 сут, переходят к стадии активной пролиферации. Добавление тамоксифена поддерживает senescence-фенотип клеток и предотвращает реиндукцию опухолевого роста (рис. 5, б). Полученные результаты свидетельствуют о потенциальной способности тамоксифена поддерживать клеточный арест и усиливать эффект преждевременного старения клеток эстрогензависимого РМЖ.
Рис. 5. Тамоксифен и регуляция опухолевого роста: а – окраска на β-галактозидазу клеток MCF-7 до (контроль) и после (тамоксифен) культивирования с тамоксифеном (5 мкМ, в течение 3 сут); б – световая микроскопия клеток MCF-7, культивированных в течение 3 сут в присутствии 0,2 мкМ доксорубицина и затем 10 сут в среде без доксорубицина без добавок (доксорубицин) и в присутствии 5 мкМ тамоксифена (доксорубицин + тамоксифен)
Доксорубицин-индуцированное старение клеток эстрогеннезависимого рака молочной железы. Как известно, резистентность клеток РМЖ к тамоксифену, как врожденная, так и приобретенная, является одним из основных факторов, ограничивающих противоопухолевый эффект гормональной терапии. С учетом описанного выше участие тамоксифена в поддержании доксорубицин-индуцированного старения представляло безусловный интерес и обусловливает важность исследования эффективности индуцированного старения в тамоксифенрезистентных клетках РМЖ. Эксперименты проводились на модели врожденной гормональной резистентности – на клетках трижды негативного РМЖ MDA-MB-231 и на клетках с приобретенной резистентностью к тамоксифену MCF-7/T, полученных в результате длительного культивирования родительских клеток MCF-7 с этим препаратом. Как отмечалось выше, выявлено, что чувствительность к рост-ингибирующему действию доксорубицина клеток MCF-7 сравнима с чувствительностью клеток MDA-MB-231, в то время как клетки MCF-7/T отличались существенно более высокой чувствительностью к этому препарату (см. рис. 1). Как и в случае с клетками MCF-7, прекультивирование резистентных клеток MCF-7/T и MDA-MB-231 с доксорубицином в течение 3 сут приводит к индукции характерных для стареющих клеток изменений: активации β-галактозидазы, клеточному аресту (рис. 6) и активации р53/р21-сигналинга (рис. 7). При этом резистентные клетки MCF-7/T отличаются значительно более выраженной активацией β-галактозидазы под действием доксорубицина, что коррелирует с большей чувствительностью этих клеток к рост-ингибирующему действию данного препарата. Добавление тамоксифена сопровождается дополнительной активацией β-галактозидазы, причем даже в рецептор-отрицательных клетках MDA-MB-231, что свидетельствует о возможных рецепторнезависимых эффектах этого лекарственного средства.
Рис. 6. Тамоксифен и резистентные клетки. Клетки MCF-7/T и MDA-MB-231 культивировали в течение 3 сут без добавок (а) и в присутствии 0,2 мкМ доксорубицина (б, в) с последующей отменой доксорубицина и продолжением культивирования без добавок (б) и в присутствии 5 мкМ тамоксифена (в) в течение 3 сут. Окраска на β-галактозидазу
Следует отметить, что если клетки MCF-7 экспрессируют р53 дикого типа, то для клеток MDA-MB-231 характерна онкогенная мутация p53-R280K, блокирующая апоптотический потенциал р53 [23]. Согласно представленным результатам, несмотря на мутантный р53, клетки MDA-MB-231 отвечают на доксорубицин и активацией р21 – одного из основных физиологических блокаторов клеточного цикла, и остановкой клеточного деления, что свидетельствует о реализации в данном случае р53-независимого механизма блока пролиферации и апоптоза.
Рис. 7. Тамоксифен и резистентные клетки: иммуноблоттинг образцов клеток. Клетки MCF-7/T и MDA-MB-231 культивировали с доксорубицином (Dox) и тамоксифеном (Tam) по схеме, приведенной на рис. 6. Представлены результаты одного из 3 независимых экспериментов. ERα – рецептор эстрогенов α
В целом полученные данные свидетельствуют о плейотропных эффектах тамоксифена в клетках РМЖ, приводящих, в том числе в эстрогеннезависимых клетках, к частичному клеточному аресту и дополнительной стимуляции нерепликативного старения.
ДНК метилтрансферазы, апоптотический сигналинг и нерепликативное старение. Согласно полученным ранее данным, длительное культивирование клеток MCF-7 c тамоксифеном приводит к выраженному подавлению экспрессии и активности DNMT3А. Мы продемонстрировали, что формирование эстрогеннезависимого фенотипа может быть ассоциировано с конститутивным подавлением DNMT3А и активацией апоптотического сигналинга. Эти изменения характерны также для клеток MCF-7/T и MDA-MB-231 [24].
В проведенных экспериментах для исследования роли DNMT в индукции нерепликативного старения клетки MCF-7 без обработки и предобработанные доксорубицином культивировали в присутствии ингибитора DNMT децитабина с последующим определением активности β-галактозидазы и экспрессии профильных сигнальных белков. Каки в случае с тамоксифеном, действие децитабина на необработанные клетки не приводило к повышению активности β-галактозидазы (рис. 8, а). В то же время культивирование с децитабином клеток, предобработанных доксорубицином, поддерживало высокий уровень β-галактозидазы, сопровождалось стимуляцией в клетках р53-сигналинга (рис. 8, б, в) и приводило к последующему торможению реиндукции опухолевого роста (рис. 8, г).
Рис. 8. Децитабин и доксорубицин-индуцированное старение клеток MCF-7. Клетки MCF-7 без обработки (а) и предобработанные доксорубицином (Dox) (б) культивировали в отсутствие или в присутствии ингибитора DNMT децитабина (DAC) в течение 3 сут с последующим определением активности β-галактозидазы, затем проводили иммуноблоттинг клеточных экстрактов (в). Восстановление клеточного роста через 10 сут после предобработки доксорубицином и культивирования клеток с децитабином – световая микроскопия (г). ERα – рецептор эстрогенов α
Участие DNMT3A в регуляции нерепликативного старения подтверждено в экспериментах по нокдауну DNMT3A при трансфекции shRNA DNMT3A. Мы показали, что подавление экспрессии DNMT3A (рис. 9, а) приводит кзаметному снижению скорости роста (рис. 9, б) и поддержанию высокого уровня (рис. 9, в) β-галактозидазы в клетках MCF-7, предобработанных доксорубицином.
Рис. 9. Нокдаун ДНК-метилтрансферазы 3А (DNMT3A) и чувствительность клеток MCF-7 к доксорубицин-индуцированному старению. Экспрессия DNMT3A в клетках, трансфицированных shDNMT3A (а). Восстановление роста (б) и активность β-галактозидазы (в) в контрольных и shDNMT3A-трансфицированных клетках после предобработки доксорубицином
В целом полученные данные свидетельствуют о том, что подавление DNMT3A относится к числу факторов, поддерживающих нерепликативное старение опухолевых клеток, и позволяют рассматривать соединения – негативные регуляторы DNMT3A – в качестве агентов, стабилизирующих состояние клеточного старения и предотвращающих реиндукцию опухолевого роста.
Обсуждение
Хорошо известно, что одним из ключевых свойств опухолевой клетки является иммортализация – отсутствие репликативного старения, характерного для соматических клеток [25]. В его основе лежит исходно ограниченное (в результате неизбежного сокращения длины теломер, концевых повторов ДНК, при каждом цикле деления) число делений, которое может претерпеть соматическая клетка. В подавляющем большинстве опухолевых клеток репликативное старение не происходит благодаря гиперактивации теломеразы – фермента, восстанавливающего длину теломер. Такая способность опухолевых клеток к неограниченному делению во многом определяет высокий уровень злокачественности опухолей, их быстрый рост и распространение по всему организму.
В то же время сравнительно недавно обнаружен эффект так называемого нерепликативного старения опухолевых клеток, индуцированный сублетальными дозами химиопрепаратов или облучением. Клетки после такого воздействия не погибают, но прекращают делиться и постепенно приобретают фенотип классических стареющих клеток (senescence phenotype), для которого характерны гиперактивация β-галактозидазы, изменение морфологии, снижение ростового сигналинга и активация апоптотического сигналинга. Характерной особенностью стареющих клеток является формирование специфического секретома – SASP (senescenceassociated secretory phenotypes), в состав которого входят биологически активные соединения разнонаправленного действия, в том числе цитокины, ростовые факторы, хемокины, проапоптотические факторы и проч. [26, 27]. Установлено, что определенную роль в реализации эффектов SASP играют экзосомы, продуцируемые стареющими клетками и доставляющие в окружающие клетки-реципиенты отдельные факторы SASP [28, 29]. Основное внимание исследователей направлено на изучение дистанционных, пара- и аутокринных эффектов SASP, определяющих собственно дальнейшую судьбу стареющих опухолевых клеток. Существуют 2 варианта нерепликативного старения: оно оказывается необратимым, и в опухолевых клетках в течение неопределенного времени поддерживается senescence-фенотип, или происходит реиндукция опухолевого роста, и клетки возвращаются к стадии активной пролиферации. Оба варианта в той или иной степени регулируются факторами SASP [30, 31]. Отдельный интерес представляют паракринные эффекты SASP, а именно – влияние клеток, находящихся в состоянии нерепликативного старения, на окружающие ткани. В первую очередь это индукция senescence-подобных и опухолеподобных изменений в окружающих клетках, в том числе хромосомной нестабильности, метаболического репрограммирования, а также активация сигнальных каскадов, что может стимулировать процесс нерепликативного старения или опухолевую трансформацию в окружающей ткани [32].
Современные подходы к исследованию нерепликативного старения опухолевых клеток включают разработку способов предотвращения реиндукции опухолевого роста и поддержания клеток в состоянии senescence и поиск и изучение соединений-синолитиков, направленно воздействующих на senescence-клетки и снижающих паракринную активность SASP-факторов.
В настоящей работе использована модель доксорубицин-индуцированного старения клеток РМЖ. По данным литературы [33] и результатам нашего исследования, культивирование клеток MCF-7 с сублетальными дозами доксорубицина приводит к формированию характерного фенотипа классических стареющих клеток – пролиферативному блоку, повышению активности β-галактозидазы, активации р53/р21-сигналинга. Установлено, что присутствие антиэстрогена тамоксифена усиливает и поддерживает клеточный арест и сопровождается резким повышением активности β-галактозидазы, что свидетельствует о свойстве этого препарата потенцировать доксорубицин-индуцированное старение клеток РМЖ. Такой же потенцирующий эффект тамоксифена подтвержден в экспериментах на тамоксифенрезистентной сублинии MCF-7/T, отличающейся изначально более высокой чувствительностью к доксорубицину и относительно низкой – к рост-ингибирующему действию тамоксифена. И в наших предыдущих исследованиях, и в работах других авторов отмечалась возможность off-target-эффектов тамоксифена, развивающихся без участия эстрогенового сигналинга [34–36]. Скорее всего, в случае с тамоксифенрезистентными клетками мы сталкиваемся с подобным действием данного препарата, результатом которого является усиление эффектов нерепликативного старения. Подтверждением этому являются результаты экспериментов на клетках трижды негативного РМЖ MDA-MB-231: добавление тамоксифена к доксорубицин-индуцированным клеткам сопровождалось усилением пролиферативного блока и гиперактивацией β-галактозидазы. Таким образом, тамоксифен можно отнести к соединениям, усиливающим и поддерживающим клетки РМЖ в состоянии нерепликативного старения.
Ранее мы обнаружили, что клетки резистентного РМЖ, такие как MCF-7/Т и MDA-MB-231, гиперчувствительные к доксорубицин-индуцированному старению, отличаются низким уровнем DNMT3A, и показали возможность негативной регуляции DNMT3A тамоксифеном [24]. Результаты настоящей работы продемонстрировали, что подавление DNMT3A в присутствии децитабина или при нокдауне DNMT3A с помощью shRNA обеспечивает усиление и сохранение senescence-фенотипа в клетках MCF-7, что позволяет рассматривать снижение активности DNMT3A как один из факторов, участвующих в поддержании нерепликативного старения клеток.
Заключение
В ходе исследования установлена возможность усиления иподдержания нерепликативного старения в клетках РМЖ в присутствии антиэстрогена тамоксифена независимо от степени гормональной зависимости клеток, что, скорее всего, является следствием нерецепторной активности тамоксифена. Впервые установлено, что подавление экспрессии ДНК метилтрансферазы 3А потенцирует эффект преждевременного старения и предотвращает реиндукцию опухолевого роста в клетках РМЖ.
Источник: Успехи молекулярной онкологии №3, 2025 год
1. Di Micco R., Krizhanovsky V., Baker D. et al. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nat Rev Mol Cell Biol 2021;22(2):75–95. DOI: 10.1038/s41580-020-00314-w
2. Sedrak M.S., Cohen H.J. The Aging-cancer cycle: mechanisms and opportunities for intervention. Gerontol A Biol Sci Med Sci 2023;78(7):1234–8. DOI: 10.1093/gerona/glac247
3. Razgonova M.P., Zakharenko A.M., Golokhvast K.S. et al. Telomerase and telomeres in aging theory and chronographic aging theory (review). Mol Med Rep 2020;22(3):1679–94. DOI: 10.3892/mmr.2020.11274
4. Hornsby P.J. Telomerase and the aging process. Exp Gerontol 2007;42(7):575–81. DOI: 10.1016/j.exger.2007.03.007
5. Rossiello F., Jurk D., Passos J.F. et al. Telomere dysfunction in ageing and age-related diseases. Nat Cell Biol 2022;24(2):135–47. DOI: 10.1038/s41556-022-00842-x
6. Montégut L., López-Otín C., Kroemer G. Aging and cancer. Mol Cancer 2024;23(1):106. DOI: 10.1186/s12943-024-02020-z
7. Colucci M., Sarill M., Maddalena M. et al. Senescence in cancer. Cancer Cell 2025;43(7):1204–26. DOI: 10.1016/j.ccell.2025.05.015
8. Schmitt C.A., Wang B., Demaria M. Senescence and cancer – role and therapeutic opportunities. Nat Rev Clin Oncol 2022;19(10):619–36. DOI 10.1038/s41571-022-00668-4
9. Wang L., Lankhorst L., Bernards R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nat Rev Cancer 2022;22(6):340–55. DOI: 10.1038/s41568-022-00450-9
10. Guillon J., Petit C., Toutain B. et al. Chemotherapy-induced senescence, an adaptive mechanism driving resistance and tumor heterogeneity. Cell Cycle 2019;18(19):2385–97. DOI: 10.1080/15384101.2019.1652047
11. Bisht A., Avinash D., Sahu K.K. et al. A comprehensive review on doxorubicin: mechanisms, toxicity, clinical trials, combination therapies and nanoformulations in breast cancer. Drug Deliv Transl Res 2025;15(1):102–33. DOI: 10.1007/s13346-024-01648-0
12. Van der Zanden S.Y., Qiao X., Neefjes J. New insights into the activities and toxicities of the old anticancer drug doxorubicin. The FEBS J 2021;288(21):6095–111. DOI: 10.1111/febs.15583
13. Arcamone F., Cassinelli G., Fantini G. et al. Adriamycin, 14-hydroxydaunomycin, a new antitumor antibiotic from S. peucetius var. caesius. Biotechnol Bioeng 1969;11(6):1101–10. DOI 10.1002/bit.260110607
14. Cortés-Funes H., Coronado C. Role of anthracyclines in the era of targeted therapy. Cardiovasc Toxicol 2007;7(2):56–60. DOI: 10.1007/s12012-007-0015-3
15. Huang Z., Lin S., Long C. et al. Notch signaling pathway mediates Doxorubicin-driven apoptosis in cancers. Cancer Manag Res 2018;10:1439–48. DOI: 10.2147/cmar.s160315
16. Synowiec E., Hoser G., Bialkowska-Warzecha J. et al. Doxorubicin differentially induces apoptosis, expression of mitochondrial apoptosis-related genes, and mitochondrial potential in BCR-ABL1-expressing cells sensitive and resistant to imatinib. BioMed Res Int 2015;2015:673512. DOI: 10.1155/2015/673512
17. Karabicici M., Alptekin S., Fırtına Karagonlar Z. et al. Doxorubicin-induced senescence promotes stemness and tumorigenicity in EpCAM-/CD133-nonstem cell population in hepatocellular carcinoma cell line, HuH-7. Mol Oncol 2021;15(8):2185–202. DOI: 10.1002/1878-0261.12916
18. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983;65(1–2):55–63. DOI: 10.1016/0022-1759(83)90303-4
19. Scherbakov A.M., Komkov A.V., Komendantova A.S. et al. Steroidal pyrimidines and dihydrotriazines as novel classes of anticancer agents against hormone-dependent breast cancer cells. Front Pharmacol 2017;8:979. DOI: 10.3389/fphar.2017.00979
20. Reid G., Hübner M.R., Métivier R. et al. Cyclic, proteasomemediated turnover of unliganded and liganded ERalpha on responsive promoters is an integral feature of estrogen signaling. Mol Cell 2003;11(3):695–707. DOI: 10.1016/s1097-2765(03)00090-x
21. Shchegolev Y., Sorokin D., Scherbakov A. et al. Upregulation of Akt/Raptor signaling is associated with rapamycin resistance of breast cancer cells. Chem Biol Inter 2020;330:109243. DOI: 10.1016/j.cbi.2020.109243
22. Mruk D.D., Cheng C.Y. Enhanced chemiluminescence (ECL) for routine immunoblotting: An inexpensive alternative to commercially available kits. Spermatogenesis 2011;1(2):121–2. DOI: 10.4161/spmg.1.2.16606
23. Bae Y.-H., Shin J.-M., Park H.-J. et al. Gain-of-function mutant p53-R280K mediates survival of breast cancer cells. Genes Genomics 2014;36(2):171–8. DOI: 10.1007/s13258-013-0154-9
24. Andreeva O.E., Sorokin D.V., Vinokurova S.V. et al. The effect of DNA methyltransferase 3A suppression in progression of the resistance phenotype in breast cancer cells. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2023;10(4):149–56. DOI: 10.17650/2313-805X-2023-10-4-149-156
25. Hanahan D., Weinberg R.A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 2011;144(5):646–74. DOI: 10.1016/j. cell.2011.02.013
26. Faget D.V., Ren Q., Stewart S.A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nat Rev Cancer 2019;19(8):439–53. DOI: 10.1038/s41568-019-0156-2
27. Niklander S.E., Lambert D.W., Hunter K.D. Senescent cells in cancer: wanted or unwanted citizens. Cells 2021;10(12):3315. DOI: 10.3390/cells10123315
28. Kadota T., Fujita Y., Yoshioka Y. et al. Emerging role of extracellular vesicles as a senescence-associated secretory phenotype: Insights into the pathophysiology of lung diseases. Mol Aspects med 2018;60:92–103. DOI: 10.1016/j.mam.2017.11.005
29. Jakhar R., Crasta K. Exosomes as emerging pro-tumorigenic mediators of the senescence-associated secretory phenotype. Int J Mol Sci 2019;20(10):2547. DOI: 10.3390/ijms20102547
30. Yamauchi S., Takahashi A. Cellular senescence: mechanisms and relevance to cancer and aging. J Biochem 2025;177(3):163–9. DOI: 10.1093/jb/mvae079
31. Shimizu K., Inuzuka H., Tokunaga F. The interplay between cell death and senescence in cancer. Sem Cancer Biol 2025;108:1–16. DOI: 10.1016/j.semcancer.2024.11.001
32. Gorgoulis V., Adams P.D., Alimonti A. et al. Cellular Senescence: defining a path forward. Cell 2019;179(4):813–27. DOI: 10.1016/j.cell.2019.10.005
33. Ewald J. A., Desotelle J.A., Wilding G. et al. Therapy-induced senescence in cancer. J Nat Cancer Inst 2010;102(20):1536–46. DOI: 10.1093/jnci/djq364
34. Semreen M.H., Alniss H., Cacciatore S. et al. GC-MS based comparative metabolomic analysis of MCF-7 and MDA-MB-231 cancer cells treated with tamoxifen and/or paclitaxel. J Proteomics 2020;225:103875. DOI: 10.1016/j.jprot.2020.103875
35. Lin H., Ai D., Liu Q. et al. Natural isoflavone glabridin targets PI3Kγ as an adjuvant to increase the sensitivity of MDA-MB-231 to tamoxifen and DU145 to paclitaxel. J Steroid Biochem Mol Biol 2024;236:106426. DOI: 10.1016/j.jsbmb.2023.106426
36. Sorokin D., Shchegolev Y., Scherbakov A. et al. Metformin restores the drug sensitivity of mcf-7 cells resistant derivates via the cooperative modulation of growth and apoptotic-related pathways. Pharmaceuticals (Basel) 2020;13(9):206. DOI: 10.3390/ph13090206
